Two-temperature PCR與PCR的差別

Two-temperature PCR與PCR的差別?

為何要使用Two-temperature PCR?

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    1 decade ago
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    先從PCR的基本原理來了解

    ==> [知識+] PCR的內容

    所以基本PCR步驟包含以下數項

    Initial denaturation : 95~98℃, 30 sec~5 min Denaturation : 95~98℃, 5~30 sec Annealing : 50~72℃, 10~60 sec Extrnsion : 70~72℃, 15~60sec/1kb (此步驟時間需乘以產物長度)

    2.~4. 重複25~40次 Final extension : 72 ℃, 1~20min

    其中denaturation及Extrnsion所需的溫度與時間的設定,是依照聚合酶的特性而定。而annealing的溫度主要則是依據引子(primer)的設計而定的。引子越長或GC比值較高,會需要較高的annealing溫度(此溫度通常簡稱為Tm);時間則是依照聚合酶的特性。

    計算Tm值的線上程式 若引子含有為了序列嵌合時所留的片段,該區域不列入計算。

    當Tm值接近或超過Extrnsion溫度時,會將 annealing與Extrnsion(反應步驟3、4)設為同一溫度,反應循環從2,3,4簡化為2,3,這稱為two-step或two-temperature。

    與標準的3-step相比,除了時間略為縮短外(因為減少機器升降溫所需的時間),另外就是使用較長的引子可增加反應專一性及較高的annealing溫度可減少primer-dimer或template DNA二級結構所造成的非專一性產物。

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