Anonymous
Anonymous asked in 科學動物學 · 1 decade ago

ELISA測兔抗魚力價問題

本人對ELISA有概念,但是只做過一次,所以詳細步驟不是很熟~

現在學長丟一個小實驗給我,想問清楚步驟又怕麻煩到學長,所以上來問一下!

有魚血漿還有兔抗魚血清要用ELISA測定力價,用96well做的,有羊抗兔血清!

想請問詳細方法如何?要能附加使用物品跟劑量!~要清楚

還有中間要清洗三次的溶液也不太懂那部份~

Update:

對了~他說魚血漿要定量,要如何定?

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  • 1 decade ago
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    這種東西不能偷懶或不好意思,非問清楚不可。特別是........當這個東西在你們實驗室可能有一個固定的做法的時候。如果你用了跟人家不一樣的做法,做出來的結果跟別人不一樣,到時以誰的結果為準?最後一定得有人重做。不就變事倍功半了?如果你不敢問,就先去翻翻lab裡畢業生的論文,裡面應該會提到相關的做法,依畢業的學長姐的材料與方法裡的方法去做,出的包會最小。如果真的不能從頭問到底,那後面提到的會告訴你哪些重點該問,哪些可以省掉。

    首先,先將魚血漿做蛋白質定量,也就是測定血漿裡的蛋白質濃度。測定濃度的方法很多,最懶的就是直接測OD280,要不然還有Lowry、Biured,或是直接用BIORAD的KIT做,不知道你們lab用什麼方法,所以無從建議。也因為同一個樣本用不同的方法定出來的量會不一樣,所以一定要搞清楚lab用的是什麼方法,用那種方法去定量以後才能讓人repeat你的結果。

    測定完蛋白質的濃度以後,接下來就是鍍盤,也就是讓你的魚血漿黏在盤子上。首先要問的,就是多少濃度?依我的經驗從0.1~10ug/ml的蛋白質濃度的盤子都鍍過,那個濃度最好?你們lab習慣用那個濃度?不知道,你只能問或者試。

    決定那個濃度以後,再來就是用什麼buffer泡,一般用PBS,但有的樣本特別,得用carbonate buffer效果會比較好,也有的要用偏酸的。你們lab習慣用什麼?雖然用PBS多半會有效果,你還是問過比較好。至於要泡多少,就看你們lab習慣在鍍盤時一個well裡加多少體積。有的人加100ul,有的習慣加200ul,你也要搞清楚或決定每孔要多少,共幾盤,算出總共需要的數量以後再多加一些作為損耗,這就是你要配的數量。

    還有就是你的blocker的種類,大體上用的buffer和前面的不會有差,但是也要搞清楚你們lab習慣用什麼當blocker,有的用skim milk,有的用BSA,你必須弄清楚你們lab用的是什麼還有濃度好算出需要的量。

    確認好這些東西以後,才勉強算可以開始。首先就是把你要鍍盤的溶液依妳鍍盤的量加入每個well中,加完就全部疊在一起,如果太高就分兩落或三落,最上面一盤用膠膜貼住,然後......看你們的設備跟習慣,37C放兩小時或是4C O/N都可以,然後拿出來,放在室溫下回溫起碼半小時,接下來到水槽邊把裡面的液體甩乾,然後每個孔加入清洗液(一般用PBST)300ul到加滿都可以,再甩掉裡面的液體,再次在每個孔加入清洗液,又甩掉裡面的液體,又在每個孔裡面加入清洗液後就甩乾後在吸水紙上拍乾,這樣就叫洗三次,運用這種方法將沒有結合在盤子上的魚血漿洗掉。然後加入blocker,看你們習慣要放在37C或室溫或4C都可以,從兩個小時到o/n都行,隨你們習慣。接下來甩掉拍乾就好,絕對不要洗盤!然後隨你們的習慣看要用真空抽兩小時乾燥或是放在乾燥室或箱裡乾燥甚至在hood吹乾都行。乾完以後用加乾燥包放在鋁箔袋裡備用。

    ELISA plate準備好以後就比較簡單了,接下來就是比較一般的操作方式,我假設你們lab只用最基本的兩倍稀釋,反應的體積是100ul,你就在第一孔裡加入100ul的兔抗魚血清,後面的孔每一孔你都已經先加好了100ul的PBS,接著你加入100ul的兔抗魚血清到第二孔,pipeting(就是你把血清加入第二孔的PBS後,抽吸幾次讓血清跟PBS混合均勻)後,再吸取第二孔的混合液100ul加到第三孔,再pipetting後又吸100ul到第四孔,又pipetting後........一直重複上述步驟直到你想做的最後一孔,pipetting後吸100ul丟棄,接下來看你們lab習慣放37C或室溫都行,放個半小時到一小時皆可(以lab習慣為主),再洗三次拍乾。

    然後......這一部份你無論如何要問清楚,因為這裡所謂的羊抗兔血清到底是單純的Sheep anti-rabbit serum還是Enzyme(Peroxidase or Alkaline phosphotase) conjugated sheep anti- rabbit serum。如果是前者,那你還要再加一次Enzyme conjugated Ab,如果是後者加完洗完就呈色了。不管是那一者,在這步的操作方法都一樣,就是用PBS稀釋到你們lab通常使用的稀釋倍數後(或是依經驗),再加入100ul到每個well內。然後又依你們的操作方式看要在37C或室溫放半小時到一小時都洗,又洗三次拍乾。

    2009-07-13 00:17:50 補充:

    如果你們用的是單純的Sheep anti-rabbit serum,那就再用不知道你們用什麼動物的Enzyme conjugated anti- rabbit serum重複上一段的步驟接著呈色。如果是用Enzyme conjugated sheep anti- rabbit serum,現在就能開始呈色,將你們lab用的呈色液加入100ul(一般而言)到每個well,在37C或室溫下呈色,有的lab習慣會等一個固定時間,有的習慣用肉眼看,

    2009-07-13 00:22:39 補充:

    反正到了適當的時候加入終止液。終止液的種類也隨呈色液而定,加入後再以適用於呈色液的波長用ELISA reader讀取結果並判讀。

    或許你可以說我給你的方法是一個填空題,很多地方都還要是你們lab的儀器設備以及材料來決定怎麼操作。不過這部份本來就沒有一定,看你們lab習慣用什麼為主。所以,我還是建議先查查lab裡畢業學長姐的論文,再視情況調整吧。

    Source(s): 我的經驗, 我的經驗
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