Sugarzoe asked in 科學生物學 · 1 decade ago

〔急〕Real-time PCR

將RNA轉成cDNA後,用一般PCR拿actin當primer PCR

確認我的Sample沒有問題

接下來就直接拿這些sample進行Q-PCR

結果是NTC和sample被放大的倍數是一樣的

melting curve非常專一(包括NTC都有起來)

跑膠後,NTC是空的

但sample的部份全都smear

請問 這是怎麼一回事?

ps:是用SYBR GREEN

5 Answers

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  • 1 decade ago
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    一次失敗的結果...

    有幾個問題需要你自己先好好思考一下...

    1. 請問你做cDNA前所使用的RNA量以及下去跑Q-PCR時所使用的量是否經過稀釋,做一個簡單的serial dilution test,目的是要知道你該使用什麼樣的濃度才能amplify出products.

    2. 請問你是否test過最適當的primer concentraction? 從你所說的NTC和sample的CT值相同,大多都是primer dimer的影響. 這也可以從melting curve看出,依你所說的 - 非常專一,表示你所看到的peak只有一個,是在70度附近,所果你有夾出東西的話,sample另一個在85度附近的peak.

    3. 你的primer在做一般PCR的時候,要確定沒問題. 先去試試以接近Q-PCR condition的條件,做看看. 畢竟一般PCR的primer不見得適用Q-PCR. (不過,倒是覺得沒這麼衰)

    先試試吧,sample以及primer concentraction.

    Source(s): me
  • 1 decade ago

    只能說你的PCR condition尚未optimize, 因為從agarose gel electropgoresis的結果看來, sample 是smear的狀況,表示PCR尚有很多需要改進的地方,例如template 濃度太高, annealing temperature 太低.....若從agarose gel上看起來不是single band,建議你把PCR條件抓好,甚至換一組primers, 這對你以 SYBR Green的系統來分析會比較順利一點,若是你要改以TaqMan Probe的系統,則就另當別論了,有其他問題也可mail給我

    Source(s): 實戰經驗
  • 1 decade ago

    跑膠後,全部黏在一起的smear

    另外,不是primer dimer

    因為連最下面的累積都沒有

  • VBC
    Lv 7
    1 decade ago

    該不會是primer dimer.......

    請檢查primer的專一性。還有,產物長度大約是多少?作SYBR Green時通常都設計只有1~200bp,電泳的解析範圍也應該在此區間。

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  • 1 decade ago

    問一下 你ㄉSAMPLE 有沒特別明顯的節點?還是全部都黏在一起 這樣有點難判斷

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