western blot的background問題

Question

b-actin壓片完背景很乾淨

但sample的background很黑

二抗完已經用0.1TBST洗兩小時

換的頻率也很頻繁

一抗用1:1000

二抗1:5000

該怎麼調整

二抗再稀釋嗎

或提高Tween 20的濃度

Answer 1

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背景很黑有兩種狀況

1. 壓片時間長，而背景很黑：壓片時間很長，自然會呈現一些雜訊，背景比較黑是正常的，可以嘗試提高抗體的濃度來改善，提高抗體濃度是訊號增強，縮短壓片時間，可以讓背景的黑減少。或者使用高靈敏度的 ECL substrate 這樣也可以改善。

2. 壓片時間短，而背景很黑：那代表抗體濃度太高了，抗體與蛋白質的結合是一種平衡反應，抗體加的多就會與一些非專一性蛋白質結合，所以背景值會高。我覺得你可以把二抗稀釋成 1:20000，一抗也可稀釋成 1:2000。

另外，抗體變質（例如抗體溶液酸敗結塊）也會造成背景值增加，因為有些菌體表面蛋白會也會與抗體結合。

Answer 2

blocking solutin 更換看看吧~ 有時候裡面純不純你是很難直接判斷的~

買個BSA來泡可能比較安心一點