閔翔 asked in 科學生物學 · 1 decade ago

primer和probe差別,如何做 急急急~

1.primer和probe差別 ?? 我知道2個都是single nucleotide 想了解到底差在哪?

2primer和probe如何做? 我知道primer是自己設計出來叫廠商做的

那probeㄋ 以及如何在probe label P32

3我要做southern blotting實驗,請大大幫我看是否有錯誤??

一開始先把要研究的片斷用EZ切下

然後設計primer 跑pcr讓我要研究片段大量表現 ,之後把這些DNA跑gel,再用強鹼處理始DNA denature在進行transfer to NC paper

,在加入probe進行hybridization,有抓到壓片就會看到band(p32)

(所以我才想問primer和probe都是設計好 請廠商幫你做ㄇ?? 所以也代表primer和probe設計的nucleotide (例如都是設計ATCG要認TAGC)都是相同囉? 因為不都可以認到我們要研究的dna序列)

問題有點多 請大大幫小弟解答

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    關於第一個問題:primer 用於 PCR 反應,作為 DNA 聚合脢的起始片斷,一般沒有特殊設計下需要一對(兩個),才能夠完整反應。probe 則用於 Southern blot 中作為目標基因的互補即可,可以是雙股也可以是單股,長度也比較靈活,可以是較長的片段也可以是合成的 oligonucleotides。

    關於第二個問題:如果你的 probe 要用 oligonucleotide 那可以請廠商合成,並且參考實驗室的設備請廠商連同標記一起合成上去。但是我在你的問題中看到你想使用放射線標記,一般廠商是不會幫你做放射線標記,原因有二:1. P32 半衰期只有14 天左右,合成後交給你在一個月之後只剩下25%強度,所以很少人願意這樣做。2. 更重要的廠商必須有很多執照才能作這樣的服務,並不划算。一般廠商會做例如:biotin label 或螢光標記。在你的實驗是必須使用放射線標記的時候,那你需要買 r-P32 ATP 然後使用 T4 polynucleotide kinase 進行 5'端的放射線標記。

    另一種 probe 的製備方式則由你已經 clone 出來的DNA 片段,用 T4 DNA polymerase 來進行標記,這時候要使用 a-P32 ATP,別弄錯了!

    關於第三個問題:基本上覺得你的設計有點多此一舉,要偵測樣品中是否有 target 基因,使用 PCR 或 Southern blot 中的其中一種就可以了,不需要兩種都做,沒有什麼意義。以經設計 primer 來PCR 目標基因了,已經有專一性了,不需要再來一次 southern。頂多是調整一下PCR的條件讓專一性更好就好了。一般 Southern 的對象是 total genome,而不是 PCR 的結果。

    Source(s): 自己的經驗
  • Anonymous
    1 decade ago

    primer和probe差別??

     一個基因 通常很常 少則一百多個鹼基(base: 即A, C, T, G) 多則上千個

     所以 要鑑定一個基因 有很多方式 其中 用primer複製 或probe 偵測 都是普通的方法

     所以 要先知道這個基因的序列 才可以從你想要用的”基因片段”的前端 及末端的18~24個基因序列

     設為Primer  利用這一對前及後的Primer 複製出你要的基因片段 然後跑電泳 得知是否有該基因片段 而這 primer 就由你想要用的”基因片段”的前端 及末端的基因序列 請廠商幫你做成

     

     而probe 是選取該基因片段中的一段 20~30 基因序列 做成對應的 probe

     這段對應的片段可以請廠商幫你做 至於p32 label 這也是廠商的製造方法 

     只要你跟廠商要求 就可以 

     在檢測時以你的 probe 是否會接上 才檢查檢體是否有該基因片段

     一個 primre 是複製出該片段 一個probe 是與之結合偵測是否有該片段 

     兩者異曲同工

  • 1 decade ago

    1.primer和probe的差別?

    構造上來說它們是沒有差別的,都是短的核甘酸序列,差別在於他們的功用。

    primer:通常適用做PCR反應的序列片段,用來辨識DNA上你需要的片段再開始複製起始。

    probe:通常稱為"探針" 這種序列片斷也可做辨識DNA用,但不是PCR常用的,它的功能也是接上你需要的片段,不同的是probe會帶有一些可呈色或可供辨識的片段,當它接上你需要的DNA時,你可以用儀器或呈色劑檢測出它的訊息,因此用肉眼就可辨別出你要的DNA。hybridization的反應就是用來認probe並呈現出訊號給你看的。

    2primer和probe如何做?

    基本上這兩種東西都是可請廠商幫你做的,只是probe的設計會比較複雜一點(多那個給hybridization辨識的地方),這部分你樣跟廠商討論一下比較好,若你要用PCR,一般都用primer。

    probe label P32 的部分直接詢問廠商比較好,我不知道你的片段多大,或是你要用什麼方式呈現。

  • 1 decade ago

    一般來說,既然你已經設計了primer去做PCR,那麼我想模版是不需要事先用酵素切。

    另外既然已經做了PCR,還用PCR產物去做southern,好像也有點不必要。

    不曉得你的實驗目的是什麼?

    primer是為了增幅出一個長片段,因此在兩股的5'設計短序列合成而來。

    probe指的是用以偵測的某序列片段,依照用途及專一性,長度也有所不同

    因此probe可能藉由合成,也可能需要primer來增幅

    Probe label的話,有分端點標記和body label,端點的話用klenow,body label的話就直接PCR,兩種方法各有優缺點。

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