western blot 一抗二抗

有沒有人可以清楚解釋一下 關於western blot 一抗二抗如何選擇?及功能?

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  • Anonymous
    1 decade ago
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    western blot 一抗二抗....

    ...Western blot實驗原理:

    通过电泳區分不同的组分,並轉移至固相支持物,通過特異性試劑(抗体)作為探針,對靶物質進行檢測,蛋白質的Western印迹技術结合了凝膠电泳的高分辨率和固相免疫测定的特異敏感等多種特點,可檢測到低至1~5ng(最低可到10-100pg)中等大小的靶蛋白。

    ...一抗..

    A. 先將需要檢測的抗体准備好,並决定好它们的稀釋度。

    B. 配好5%的Milk(TBST溶解),按要求稀釋好抗体。注意,如需高比例稀釋,最好採用梯度稀釋。

    C. 將稀釋好的抗体和膜一起孵育。 一般採用RT 1小时,可根據抗体量和膜上抗原量適當延長或缩短时間。

    注意:為了便于後面分析结果,我们一般會選用已確定分子量大小而且纯度高的抗体作為marker與一抗同時孵育。

    ...二抗...

    孵育 RT1 小时。 一般採用HRP標記的二抗,稀釋比例为1:5000。

    二抗的稀釋比例不能太低,否則容易導致非特異性的结合。

    注意二抗的選擇有多種,要根據一抗來選擇抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗,以及根據後面的顯色條件來選擇HRP、AP或者GOD(葡萄糖氧化酶)酶鏈的二抗或者標示其他探针(如核素等)的。

    ...依生物而實驗方法各有不同...提供參考...謝謝。

    Source(s): 生物學
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