PEGGY asked in 科學生物學 · 1 decade ago

請問RCA 技術的原理 ?

rolling circle amplification (RCA) 是一種分子生物技術, 想請教這項技術的原理為何?

Update:

請問 f29 是什麼?

Update 2:

抱歉, 請問一個 0 中間有一條線 是代表什麼?  那個符號我打不出來QQ

Update 3:

GENE大大,我總算看懂這個部份了

只是還有一些疑問

1. 您說primer不需特別設計

只要使用random oligonucleotides primer

但是,因為欲測的是未知病毒

那怎麼會知道要怎麼給primer呢?那他會如何random給呢?

2. 所以最後用限制酵素切出來的就是原始環狀DNA的片斷囉?

那要怎麼組出來完整的?

  如果用資料庫查詢的話  

 有沒有可能重組出DNA片段相同 但是順序不同的病毒?

(不好意思因為我也沒有用過這方面的資料庫查詢,所以也不知道查出來會是什麼)

1 Answer

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  • gene
    Lv 5
    1 decade ago
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    rolling circle amplification

    原理和一些phage再複製genome時用的Rolling circle replication相似

    使用的enzymer是phage f29 的f29 DNA polymerase

    因為f29 DNA polymerase具有Strand displacement(股取代)的特性

    一般常用的DNA polymerase

    (如Klenow fragment, Taq...)沒有strand displacement功能,

    當複製過程中遇到前方的primer或DNA,會停止作用、

    或是將前方DNA以5端往3端的exonuclease的功能將primer切除,

    因而無法amplification

    關於strand displacement你可以看以下的圖(不好意思找不到更好的圖)

    圖片參考:http://www1.qiagen.com/products/GenomicDnaStabiliz...

    圖1和圖2是一般DNA polymerase,

    當複製過程中DNA polymerase遇到前方有primer時...

    會停止作用,或是將primer切除...

    而圖3和圖4是strand displacement

    當複製過程中DNA polymerase遇到前方有primer時...

    會把擋前方的primer和DNA strand移出,換成自己合成的DNA...

    但不是切除前方的primer和DNA strand

    然後就是RCA的反應原理...

    1.random oligonucleotides作為primer,

    和環型DNA 雜化後,以f29 DNA polymerase進行DNA合成

    2.當DNA合成進行到遇到前方的primer時,

    f29 DNA polymerase發揮strand displacement的特性,

    把前方的DNA strand頂開並置換出去,

    繼續進行其DNA進行複製...

    3.而被以strand displacement置換出來的DNA strand又可被random oligonucleotides primer作為template.

    然後又開始了另一個DNA複製

    4.然後每個random oligonucleotides primer都可以不斷繞著環狀DNA進行Rolling circle replication...

    5.然後就能複製出環形DNA的DNA片段...

    以下是作用原理的圖示

    圖片參考:http://www.coa.gov.tw/htmlarea_graph/web_articles/...

    優點是...

    作用環境是恆溫,不像一般PCR需要冷熱循環...

    反應在30度C下進行,所以只要在恆溫槽就能進行

    然後primer不需要特別設計,random primer就能進行

    DNA必須是環形的才可以被amplification

    因為這個特性,一般用於一些病毒感染的檢測...

    因為人類的genome是線性的,不會被amplification

    而某些病毒DNA or RNA 是環形的...

    就可以用rolling circle amplification 檢測

    以上,希望對你有幫助

    2008-05-23 14:02:11 補充:

    唉呀...strand displacement的圖怎麼是個叉燒包...

    關於strand displacement大大就到以下網址參考了http://www1.qiagen.com/products/GenomicDnaStabiliz...

    2008-05-25 02:07:21 補充:

    f29是一種phage(噬菌體)的品系名稱

    random oligonucleotides primer 就是任意序列組成的primer

    常用的random primer,如Hexamer...

    Hexamer primer就是由6個隨機排列的oligonucleotides所組成的primer

    例如:ATCGAT,ACGAAC,CCCGAA或是TTTTTT...這些都是Hexamer primer

    2008-05-25 02:12:44 補充:

    為什麼可以用random primer...

    因為這種檢測方法在進行完RCA後,

    會再用Restriction enzyme 處理後再run gel...

    然後再由gel上顯現的band來判斷是否有某種病毒感染...

    這後半段的步驟和另一個檢測方法有關,RFLP

    2008-05-25 02:12:51 補充:

    RFLP( Restriction fragment length polymorphism )

    關於RFLP大大可以參考: http://en.wikipedia.org/wiki/RFLP

    不同序列DNA片段用同一種Restriction enzyme切割

    切點位置和數目是不同的(相同的機率非常低)

    所以根據這些切點的切位和數目比對資料庫上的資料

    就能知道是哪一種病毒的環型核酸...

    2008-05-25 02:13:12 補充:

    RCA不是用來重組出完整的病毒DNA的

    因為他在複製時是不斷的進行環形複製的

    enzyme在template進行合成,

    enzyme並不一定會在template繞完"完整的一圈"才停止

    有時可能複製出半圈就enzyme失效了

    只複製出一條只有半圈的DNA

    有時enzyme可能效率較強,在template繞了1圈多甚至2圈

    複製出一條很長的DNA,包含了1圈甚至兩圈的病毒DNA

    不管是複製了半圈的DNA,或是1圈半甚至兩圈的DNA...

    用Restriction enzyme切出的DNA片段都一樣...

    所以用來分辨是哪一種環形DNA

    Source(s): 我的小腦袋
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