Yahoo Answers is shutting down on May 4th, 2021 (Eastern Time) and beginning April 20th, 2021 (Eastern Time) the Yahoo Answers website will be in read-only mode. There will be no changes to other Yahoo properties or services, or your Yahoo account. You can find more information about the Yahoo Answers shutdown and how to download your data on this help page.

俐伶 asked in 科學化學 · 1 decade ago

pcr一直try不出來

pcr已經做了很多次了,後來DNA量要加到5入,即可做出來,和老師討論後,想說是不是降溫的話,DNA的量可以不用那ㄇ多,所以又測試ㄌ3個溫度分別為37度.50度和51度,可是都做不出來,想問問大家是不是DNA的濃度低的話,不論你溫度調整多少還是依樣做不出來,因為在做PCR前我都會先測DNA的濃度,濃度為8.3ug/ml,比我其他sample的DNA濃度低很多,另外,還想請問大家,是否還有什ㄇ作法(PCR)可以運用在DNA濃度低的sample上,謝謝大家

Update:

我sample的DNA是用KIT抽的

Update 2:

謝謝你的見解,是要加到50ng才做的出來,

Update 3:

而我抽的DNA是genomic DNA ,且抽出來的genomic DNA 我都有去測DNA的濃度,也沒有protein污染,

Update 4:

至於你說要降溫,我也做過了,可同樣還是要50ng才做ㄉ出來

其實我做的這個PCR program應該是沒有問題,因為我們老師有做出來,可是到我手上就做不出來,就很奇怪,後來我有想說會不會是酒精ㄉ問題,因為我的sample是保存在75%酒精中,在取出來抽genomic DNA ,且primer是universa的,理論上是應該做的出來,且我當時是一起做16個sample,就只有一個做不出來,所以就很苦惱,麻煩大家幫我一下ㄅ 謝謝

3 Answers

Rating
  • 1 decade ago
    Favorite Answer

    首先,建議20ng-100ng的template DNA在做PCR reaction時比較不會有問題.

    根據你的描述,提出幾點:

    1. 當DNA template濃度過低,增加template的量,的確會讓你的PCR成功,但是由你給的濃度和量,你加了40ng的template才做得出來,顯示,你們的PCR program並不是最理想的. (這部分可以做個anneal溫度的梯度測試,anneal不需要低於45)

    2. Kit抽的DNA? 你怎麼能確認他的quality? 跑個gel確認有無protein contaminate或是degrade?! 還有,什麼樣的DNA? genomic DNA , plasmid DNA or virus DNA??

    3. 若是你們取得DNA量不會太多且濃,建議設計nested PCR或是Real-time PCR

    a) nested PCR簡單來說,就是跑兩次PCR. (先run一次PCR後再取PCR product當template在run一次)

    b) Real-time PCR 可以測到 fg的sample.

    Source(s): me
  • 1 decade ago

    恩,看了你的意見,那我知道了,後來想想,我那時頭腦應該是沒轉過來....>

  • 1 decade ago

    這位同學

    你沒有搞懂回答者的意思

    他沒叫你降溫吧 反而是說Annealing根本不需要低於45度

    如果想知道哪個溫度出來的效果最好

    可以做Gradient PCR 回答者第一點就提到了

    還有Genomic DNA的Quality通常要用跑膠確認

    測OD不準

    況且你都跑的出產物了 再跑一次PCR不就可以放大了

    也就是回答者說的nested PCR (第三點)

Still have questions? Get your answers by asking now.