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貞淑 asked in 科學生物學 · 1 decade ago

RFLP的實驗步驟

請問有人知道RFLP

restriction fragment length polymorphism

的實驗步驟嗎??

急需!!

謝謝!!

1 Answer

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  • sally
    Lv 4
    1 decade ago
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    RFLP操作要點

    一、材料

    基因組 DNA(大於50kb,分別來自不同的材料)。

    二、設備

    電泳儀及電泳槽,照相用塑料盆5只,玻璃或塑料板(比膠塊略大) 4塊,吸水紙若干,尼龍膜(依膠大小而定),濾紙,eppendorf管(0.5ml)若干。

    三、試劑:

    1、限制性內切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩衝液。

    2、5×TBE電泳緩衝液:配方見第一章。

    3、變性液:0.5mol/L NaOH,1.5mol/L NaCl 。

    4、中和液:1mol/LTris•Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。

    5、10×SSC:配方見第九章。

    6、其它試劑:0.4mol/L NaOH,0.2mol/L Tris•Cl, pH7.5/2×SSC ,ddH2O,Agarose 0.8%, 0.25mol/L HCl 。

    四.操作步驟

    1. 基因組 DNA的酶解

    (1)大片斷DNA的提取詳見基因組 DNA提取實驗,要求提取的DNA分子量大於50kb,沒有降解。

    (2)在50μl反應體系中,進行酶切反應:

    5μg 基因組 DNA

    5μl 10×酶切緩衝液:20單位(U)限制酶(任意一種) 加ddH2 O,至50μl

    (3)輕微振盪,離心,37℃反應過夜。

    (4)取5μl反應液,0.8%瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底,這時不應有大於30kb的明顯亮帶出現。

    **[注意]未酶切的DNA要防止發生降解,酶切反應一定要徹底。

    2. Southern轉移

    (1)酶解的DNA經0.8%瓊脂糖凝膠電泳(可18V過夜)後EB染色觀察。   

    (2)將凝膠塊浸沒於0.25mol/L HCl中脫嘌呤, 10分鐘。   

    (3)取出膠塊,蒸餾水漂洗,轉至變性液變性45分鐘。 經蒸餾水漂洗後轉至中和液中和30分鐘。

    (4)預先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC中,將一玻璃板架於盆中舖一層濾紙(橋)然後將膠塊反轉放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物,以10× SSC鹽溶液吸印,維持18-24小時。 也可用電轉移或真空轉移。

    (5)取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30秒,迅速轉至0.2mol/L Tris•Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。

    (6)將膜夾於2層濾紙內, 80℃真空乾燥2小時。

    (7)探針的製備和雜交見第九章分子雜交部分。

    ** [注意]

    1、步驟(2)中脫嘌呤時間不能過長。

    2、除步驟(1)、(4)、(5)外,其餘均在搖床上進行操作。

    3、步驟(4)中,當尼龍膜覆於膠上時,絕對防止膠與膜之間有氣泡發生,加蓋濾時也不應有氣泡發生。

    4、有時用一種限制性內切酶不能發現RFLP的差異,這時應該試用另一種酶。

    參考資料來源: http://translate.google.com/translate?hl=zh-TW&sl=...

    Source(s): Google好幫手
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