Robin asked in 科學動物學 · 1 decade ago

請問粗萃取DNA純化的問題(大量純化)

請問大家

如果我買了一瓶calf thymus DNA 500mg(約10000多bp)

但是這個只是粗萃取的DNA(內含protein and RNA)

我要如何做才能純化出純的calf thymus DNA

(目前有50k的過濾管)

請大家以沒有錢買KIT的狀況來回答~~謝謝

(現有TE buffer,BPE buffer, phenol/chcl3/iaa, protease K, Rnase, 50k的過濾管)

可以給我流程嗎,包括離新條件及添加量

如果有錢,可以買哪一種KIT???

回收率可以有sample的一半嗎

Update:

可再請問一下 ,那不需要透析去除鹽類嗎?

如要溶解剛買來的dna

要以多少量的TE buffer來溶解DNA???

Update 2:

謝謝gene大大

可以再請問一個問題嗎?

您說沒有isopropanol

100%酒精可以取代

在這個時候,sample應該是溶液狀吧!!!

這樣直接加酒精下去離心,會分層嗎?

不然要怎麼隔離dna及酒精呢?

Update 3:

gene大大

你真的講的很詳細耶

請問你是哪個學校念生科的阿?

是博士班學生嗎?

我可以跟你留msn嗎?跟你交個朋友可以嗎

如果有什麼問題也可以跟你討論討論

2 Answers

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  • gene
    Lv 5
    1 decade ago
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    10000bp的DNA...

    用agarose gel很難跑下來的...所以不能用gel elution...

    用filter...50k的...會流失很多

    1.建議你可以先加入RNase,和protease k 37 ℃中作用約1小時 ...

    分解RNA和protein後...其實可以不用加protease K...

    因為之後用phenol-chloroform就能去除protein...

    因為會使proteins denaturation....

    2.然後用加入體積比1:1 phenol-chloroform

    輕輕搖晃,混合均勻...要輕輕的...

    因為DNA大約10000bp...太用力會有斷裂的危險

    3.離心13500rpm 1分鐘,

    會形成上層(水層)和下層(有機層),DNA在上層中,

    protein或一些雜質會在水層和有機層的介面上

    小心取上清液,小心不要取到介面上的雜質...

    將上清液裝到新的tube中...

    4.然後再加入大約3倍體積isopropanol,混何均勻,

    離心13500rpm,1分鐘,沉澱DNA...

    離心後會有pellet....pellet就是DNA...

    所以要小心不要把pellet吸掉了

    5.然後再用1ml 100%酒精wash一次...離心...13500rpm...

    6.再用1ml -20 ℃ 70%酒精去除鹽類...離心...13500rpm...

    這個步驟動作要快,而且酒精最好是冰的...

    因為DNA溶於水...這個步驟太久DNA會流失越多...

    7.小心去除酒精,留下pellet,pellet就是DNA,烘乾 DNA...

    8.用水或是TE buffer溶解DNA...保存在-80 ℃或-20 ℃

    希望對你有幫助...

    2007-10-26 15:47:49 補充:

    不用透析...

    用70% 酒精就能去除鹽類...

    用多少TE buffer....

    不一定耶...這要看你的DNA有多少...

    還有要看你覺得多少濃度適合...

    不過建議你再溶解DNA時,

    不要把濃度弄得太低...

    建議你保存時DNA最好高一點...

    之後要做實驗時,再依濃度需要做稀釋...

    2007-10-26 15:48:59 補充:

    如果沒有isopropanol

    100%酒精可以取代

    2007-10-26 16:52:27 補充:

    加入phenol-chloroform...離心後

    取的是上層的上清液...

    這一層是水層...DNA是溶於水...所以DNA在水層

    加入isopropanol或100%酒精...isopropanol或酒精是會溶於水的...

    並不會分層...

    這時候,去離心...

    DNA不溶於酒精或isopropanol...

    所以離心後DNA沉澱會在管子底部形成pellet...

    2007-10-26 16:53:53 補充:

    離心後你會看到管子底部有白白的沉澱物...

    這就是DNA...

    2007-10-26 17:30:16 補充:

    DNA air-dry後...

    乾燥的DNA應該是呈現透明狀的...

    如果DNA air-dry後...是呈現白白的...

    表示在DNA pellet中鹽類太多了...

    可以再用水溶解後...

    再用100%酒精再做DNA沉澱一次...

    然後再用冰的70%酒精 wash一次...

    然後再air-dry DNA...

    2007-10-27 11:44:45 補充:

    謝謝...我已經是post-doc

    基於個人隱私...

    我是不留MSN或私人電子信箱的

    不過當然歡迎一起討論摟

    之後有任何問題想和我討論...

    可以直接在我的知識(gene的知識)的首頁上方...

    有一個小按鈕...寫"直接寄信給他"

    可以從那裡直接寄信給我...其他網友都這樣做的

    以後歡迎在一起討論摟

    Source(s): 我的小腦袋
  • YCP
    Lv 5
    1 decade ago

    pH 8.0 Phenol+sample (1:1) (約各500ul) 14000rpm 5min

    取上清液

    上清液+ phenol/chcl [1:1] (1:1) 14000rpm 5min

    取上清液

    上清液+chlorofrom (1:1) 14000rpm 5min

    取上清液

    加入1 ml 100﹪EtOH(放置於-20℃),加入sample 1/10量的NaOAc溶液

    混合均勻後,放置於-20℃ 30min進行沉澱

    4℃ 13000rpm離心 30min

    移除上清液,加入75﹪EtOH 0.5 ml清洗pellet

    4℃ 13000rpm離心 15min

    移除上清液,Air dry

    加入3H20 30-50μl

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