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Athena asked in 科學化學 · 1 decade ago

關於反轉錄RT-PCR的實驗方法

最近要做反轉錄RT-PCR的實驗

但protocol看的有點不太清楚

我只知道目前我要先利用TRIzoL reagent將RNA跟DNA分離

取出RNA 之後wash

再回溶於去離子水中

得到RNA後去進行RT-PCR

加入藥品

1. 10x Transcription buffer

2. dNTP

3. Recombinat RNase Ribonuclease Inhibiter

4. Random primer

5. MgCl2

6. AMV Reverse Transcriptase

7. ddH2O

我的問題如下:

1.在這些藥品中是加入RNA pallet中還是要加入回溶在ddH2O的 RNA呢?因為在這個反應中我找不到RNA何時要加?

2.關於藥品1.3.4.6.protocol有教怎麼配製1這個buffer

但其他的是廠商提供的嗎?

3.在這個反應中結果是得到single strand cDNA嗎?

那我是不是還要再進行一次PCR去得到double strand cDNA後

再去PCR出我要的片段呢?

還是說single strand cDNA可以直接PCR我要的片段呢?

以上問題~麻煩大家幫幫忙了~謝謝!!

3 Answers

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  • VBC
    Lv 7
    1 decade ago
    Favorite Answer

    TRI reagent 操作手冊(RNA純化部分)

    在純化RNA時建議您可參考以上的操作手冊

    注意不同檢體的特異性,以達到最佳效果。

    Molecular Research Center這家公司的老闆就是TRIzol的發明人,所以還有專門從菌液或全血樣品中抽RNA的改良配方。

    進行RT-PCR前需先將RNA回溶並定量。這步驟及計算方式請看操作手冊的最後一頁。

    因為RNA通常是作為基因表現的定量依據。所以必須在所有檢體的total RNA濃度相同時才可以作比較。RT-PCR反應時每一個檢體樣本加入的總RNA量是相同的。

    ============================================

    RT-PCR的反應依照您後續的實驗需要可以有些不同。

    如果實驗室有qPCR(Real-time quantitative PCR)的設備,那只需要將RNA轉為cDNA的RT反應(reverse transcribed);後續就交由qPCR過程作精確定量。

    若僅有一般PCR設備就要作RT-PCR反應,再以電泳作比對。

    以試劑來說,可以直接購買已經搭配好的kit,就附有以上您列出的這些試劑;buffer、dNTP、AMV等。

    定量PCR用的cDNA Synthesis Kit

    RT-PCR用的kit(RT與PCR一次完成型)

    關於您的問題,

    1. RNA是在一開始就先回溶並定量好,加入一起反應。

    2. 建議選購直接配好的RT-PCR kit可以減少麻煩

    3. 您的列表沒有DNA polymerase,所以是僅得到ss cDNA。

    可以選擇RT後再進行PCR(uncoupled RT-PCR)

    或一次做完RT-PCR(one-step RT-PCR)的方式。(參考上列kit)

    2007-04-17 00:10:52 補充:

    如需自行配置各種buffer,需注意操作時所有容器與所用的水必須是RNase-free。

    您列表中之 [2. dNTP] 向購買PCR相關試劑之廠商購買即可。

    [5. MgCl2] 雖可自行配置,但除了注意RNase之外,氯化鎂是很容易受潮的。一般試藥用的氯化鎂如沒有儲存於防潮箱中,通常都會吸水結塊;水合狀態下自行配製的濃度通常都不太準。

  • 7 years ago

    到下面的網址看看吧

    ▶▶http://*****/

  • 1 decade ago

    1.嗯,您好呀,從您的問題中可以知道您對於操作分生實驗的經驗是比較少的,強列建議直接請教熟悉此操作流程的相關人士,因為可能要直接帶您親自做一次實驗您才能比較快速上手,若真的沒辦法找到人帶,請先用不重要的sample自行練習,到皆能成功反應之後再拿您所欲試驗之樣本來抽取RNA及翻完cDNA再做PCR, 簡單回答一的問題,您將您的RNA溶於DEPC-H2O後,定量過後可取 2 ug ( 此指濃度,非2ul的體積)來進行反轉錄之動作.

    2. 既然您有10倍的轉錄反應buffer了,您應該也會有同一家廠商之反轉錄酵素(藥品6)及MgCl2了,而藥品2,3,4需另外購買.

    3. 單股cDNA,可直接進行PCR夾取您所需之片段,最好先以housekeeping gene (如 beta-actin)夾取證實您反轉錄試驗有成功,再夾取您想放大之片段.

    4. 另外小弟一些小建議,在操作抽取RNA的試驗時,建議您戴口罩及手套防止您的RNA因受污染而降解,可能的話可以至Laminar flow中操作, 轉錄好的cDNA請冰於-20度C冰箱,並請趁新鮮時盡快接續做您的實驗.

    祝您試驗順利:)

    Source(s): 自己8年來的一點經驗
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