Anonymous
Anonymous asked in 科學化學 · 2 decades ago

一些Western blot的問題?

下列一些問題希望能幫忙回答,因為要上台講原理什麼的,怕會被問到。

部分回答也可,感謝~

1.做膠時加入的Tris目的是什麼?10%SDS目的是什麼?

2.檢體加2-ME目的是什麼?

3.跑電泳的running buffer不用放冰箱,為什麼transfer buffer卻要放冰箱?

4.blocking時要加脫脂牛奶的目的是什麼?為什麼是脫脂?

5.為什麼要stripping?

6.為什麼牛奶要用PBS-T泡?tween 20是做什麼用的?

感謝回答~

3 Answers

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  • 2 decades ago
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    Tris是緩衝液,可以維持pH值.

    單純用煮的無法徹底使蛋白質變為線性,尚要加入2-ME或DTT來打斷雙硫鍵,使蛋白變為線性結構,這樣跑電泳時它才會僅依分子大小來分佈

    我們實驗室running buffer和transfer buffer都有放冰箱ㄟ,你們只放transfer buffer在冰箱可能是因它含methanol的原因吧..

    加牛奶的目的就是blocking,你自己都說了,擋住membrane尚未被蛋白接住的區域,脫脂應該是不希望它含有脂類物質吧!像其他一些含鐵含鈣等一堆雜七雜八的牛奶都盡量避免.

    stripping並不是一定要做,它是把已接上去的抗體洗下再去接別的抗體,通常是要看另一種蛋白表現才需要做.

    你問牛奶為什麼要用PBS-T泡等同於問抗體為什麼要用PBS-T泡一樣,這兩各問題答案應該相同.

    為什麼膠裡要加SDS這我就不知了,不過我們也有加沒錯,可能是為了增加它電泳效率吧,我猜

  • 1 decade ago

    因為SDS是一種detergent,具有一端疏水性基團和一端親水性基團,其中親水性基帶有負電荷。所以疏水性基團會和蛋白質中疏水性胺基酸結合,破壞蛋白質立體結構而成為線性結構;而親水性基團則使蛋白質帶有負電荷。因此,蛋白質在SDS-PAGE中即可依分子量大小而有泳動距離的差異(其他因素,如立體形狀等,就不用考慮了!)。

    註:另外有nature PAGE,是不加SDS,乃為了不破壞蛋白質本來的結構。

  • 1 decade ago

    加SDS應該是要讓DNA不會讓雙硫鍵再接上

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