一些Ｗestern blot的問題？

Question

下列一些問題希望能幫忙回答，因為要上台講原理什麼的，怕會被問到。

部分回答也可，感謝～

１．做膠時加入的Tris目的是什麼？１０％ＳＤＳ目的是什麼？

２．檢體加２－ME目的是什麼？

３．跑電泳的running buffer不用放冰箱，為什麼transfer buffer卻要放冰箱？

４．blocking時要加脫脂牛奶的目的是什麼？為什麼是脫脂？

５．為什麼要stripping?

６．為什麼牛奶要用PBS-T泡？tween 20是做什麼用的？

感謝回答～

Answer 1

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Tris是緩衝液,可以維持pH值.

單純用煮的無法徹底使蛋白質變為線性,尚要加入2-ME或DTT來打斷雙硫鍵,使蛋白變為線性結構,這樣跑電泳時它才會僅依分子大小來分佈

我們實驗室running buffer和transfer buffer都有放冰箱ㄟ,你們只放transfer buffer在冰箱可能是因它含methanol的原因吧..

加牛奶的目的就是blocking,你自己都說了,擋住membrane尚未被蛋白接住的區域,脫脂應該是不希望它含有脂類物質吧!像其他一些含鐵含鈣等一堆雜七雜八的牛奶都盡量避免.

stripping並不是一定要做,它是把已接上去的抗體洗下再去接別的抗體,通常是要看另一種蛋白表現才需要做.

你問牛奶為什麼要用PBS-T泡等同於問抗體為什麼要用PBS-T泡一樣,這兩各問題答案應該相同.

為什麼膠裡要加SDS這我就不知了,不過我們也有加沒錯,可能是為了增加它電泳效率吧,我猜

Answer 2

因為SDS是一種detergent，具有一端疏水性基團和一端親水性基團，其中親水性基帶有負電荷。所以疏水性基團會和蛋白質中疏水性胺基酸結合，破壞蛋白質立體結構而成為線性結構；而親水性基團則使蛋白質帶有負電荷。因此，蛋白質在SDS-PAGE中即可依分子量大小而有泳動距離的差異(其他因素，如立體形狀等，就不用考慮了！)。

註：另外有nature PAGE，是不加SDS，乃為了不破壞蛋白質本來的結構。

Answer 3

加SDS應該是要讓DNA不會讓雙硫鍵再接上