有關in situ hybridization的問題

Question

最近作果蠅唾腺in situ hybridization結果發現在chromosom上沒有signal,推測可能是hybridization時probe沒有結合上去,想請問一下hybridization buffer所用到的formamide原液(sigma)99%與99.5%會有差別ㄇ,如果沒有那還有哪些因素會影響hybridy的效果.謝謝~^^~

Update:

請問如果是用DIG nick translation kit來標定,又該如何來檢測我的probe上是否有DIG上去?~謝謝

Answer 1

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以下都是我的猜想 並不是懷疑您的技術喔

完全沒有SIGNAL 最可能的原因是 probe的denature沒有做好 可能您使用的probe長度比較長 或者g/c比比較高 可以用比較長的時間加熱 denature完全

小弟我曾經碰過 放射性物質太衰弱 以致於壓不出signal 如果是用螢光顯色 那就要注意 buffer的製備 還有是否過期了 ㄜ 溫度也很重要

99%與99.5%就算有影響 也不會與signal的顯示與否有巨大的關連 頂多就是signal美不美而已

您可能最好補充一下是用放射性還是螢光呈色

2006-04-04 13:40:22 補充：

還有再製作probe的時候 代有螢光或者放射性磷的分子沒有加到dna probe上 這則是要檢查您的酵素 或者乾脆換瓶新的

2006-04-10 14:28:49 補充：

不是會有用來填補空白用的鮭魚精子dna嗎 把probe點在上面 不要洗掉 直接拿去呈色不就看得出來不過呢 應該會有更簡單的方法可以看probe dig的說明書上應該會有寫

2006-04-12 09:37:43 補充：

Roche Applied Science 原來您用的是這家公司的她們的東西很多人用ㄚ 也許您可以在附近實驗室問問看學長姐這樣也許比較快喔

Source(s): 自己的經驗

Answer 2

我做完Dig labelling後(PCR labelling)會跑膠,同時和label前的一起跑, Dig有上去的 band會較大, 和label前的比較就可以知道有沒有上去了.

另一個方法比較浪費, 可以將你label好的probe點在membrane上 link過後直接做成色, 當然也要把沒label的也點上去當control.

你要抓到是不是hybridize出問題造成沒有訊號, 你一定要放control, 可以用一個house keeping gene或是其他人有做出來的probe和你的probe同時做, 如果連control都沒出來, 就是hybridize的問題, 而不是Probe labelling的問題.