我想知道定位雜交的原理..步驟..有流程圖更好

我想知道定位雜交〈in situ hybridization〉的原理..步驟..有流程圖更好..謝謝

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  • 2 decades ago
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    首先 in situ hybridization 中文叫做原位雜交, 跟南方或北方點墨法最大的不同,是可以看到目標的正確位置, in situ 就是這個意思 , 所以雖然點墨法的敏感度遠大於 in situ hybridization ,但仍有許多實驗需要眼見為憑,或是知道正確位置,故原位雜交技術歷久不衰,所以要進行這個實驗基本要求是目標(target)的完整性與正確性,如果是做染色體的,需要將完整的46條固定在玻片上(以人為例),若是做胚胎發育的,需要小心的水解完整的胚胎,做病理切片的要小心去除封蠟,總之ISH第一步就是要準備好目標

    第二步要準備DNA探針,10多年前多用成色法或是Isotope,但成色法解析度太差,Isotope又太危險, 所以現在ISH的技術都採用螢光標定(Fluorescence) 即現在大家最常聽到的原位雜交 Fluorescence in situ Hybridization; 簡稱FISH 後來FISH衍伸其他技術例如GISH, CGH, SKY 等等,但無論何種方法都是把螢光物質標定在DNA之上

    第三步進行雜交 如果你的目標是DNA 則玻片和探針都要進行denature之後,降溫,讓探針附著在目標上,若目標是RNA則不需要,當然這其中牽涉到許多buffer的控制,溫度的微調,以及清洗的效果等等,這些都是要靠經驗去調整的

    最後一步,需要ㄧ台螢光顯微鏡, 現在螢光顯微鏡配上四個濾片應該不是很貴,大概100萬就可以搞定了,但最重要的還是ㄧ雙有經驗的眼睛去找出你的目標固定在何處,不然花花綠綠的螢光影像讓人眼花撩亂,是需要ㄧ段時間訓練才能找出正確目標的

    我在今年的FISH研討會上看到有廠商推出可以自動尋找目標的螢光顯微鏡,很神奇,大概500萬左右吧,我猜,這樣可以省掉訓練初學者的時間,但可能又要花一些學軟體的時間

    2006-02-27 00:09:23 補充:

    想學技術可以去陽明的分子細胞遺傳學實驗室,聽說那裡不錯

    2006-02-27 00:17:02 補充:

    不過我可不是那裏出來的喔

    Source(s): 曾經跟FISH奮戰兩年的我
  • Anonymous
    7 years ago

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  • 2 decades ago

    您可參考https://www.roche-applied-science.com/fst/publicat...

    An in situ hybridization protocol follows this general outline:

    Preparation of slides and fixation of material

    Pretreatments of material on slides, e.g., permeabilization of cells and tissues

    Denaturation of in situ target DNA(not necessary for mRNA target)

    Preparation of probe

    In situ hybridization

    Posthybridization washes

    Immunocytochemistry

    Microscopy

    Source(s): Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual
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