? asked in 科學生物學 · 2 decades ago

一連串western問題..

我最近在做western blot 分子量為18kDa and 16KDa兩條band非常接近以下有幾個問題請各位大大能幫我解答...感激不盡!!

1.我跑的GEL是15%SDS-PAGE 即使跳海了..18 AND 16KDa也是在很底部,因為

16kDa底部有一條離它很近的雜band,若改用18% commercial的gel 會不會比較改

善?有無要注意哪些事項?

2.為何我跑15%的gel其band會一胖一瘦?是protein濃度太濃了嗎?(100-150ug)體積

30ul左右(ps1.我跑的是Bio-Rad mini 2.因為我sample的表現很weak因此protein的

濃度需很濃)

3.我的Transfer condition是固定最大安培,100伏特數0.45孔徑的membrane,transfer

1hr(因為我的分子量很低不敢transfer太久,但我把gel stains還有一點點的band殘

留在 gal上)

4.有人建議我將Protein純化濃縮(通culunm)..去掉大分子的protein,但這是否會影響

我 Treat reagent的表現?是測完濃度去純化還是純化完再去測濃度?

勞煩各位謝謝!!

2 Answers

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  • 2 decades ago
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    參考一下喔

    回答:

    1. 跑 18% SDS PAGE O.K! 但會跑更久喔 ! 而且如果你有跑大片的儀器就用跑大片的比較好,要記得 denature!

    2.不知道耶!

    3.可以transfer久一點,多個十分鐘,或是調120 V,transfer 1hr

    4.不會影響,純化後再測,但是要有心理準備,protein 會lost 很多。

    建議: 找找看是否有更好用的抗體

    Source(s): 自己
  • 2 decades ago

    我有使用vivascience濃縮器 剛開始我也以為會lost很多 可是我後來把離心下來ㄉprotein保留起來 跑PAGE發現我ㄉTARGET PROTEIN沒有LOST 都留在MEMBRANE上 你可以試看看 我是用1.5CCㄉ濃縮器

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