Anonymous
Anonymous asked in 科學生物學 · 2 decades ago

關於限制酶

想請教關於限制酶在自然界的功能有哪些?

不是說現在應用在生化分生方面喔!

是在自然界的功能

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    限制酶(或稱限制酵素,restriction enzyme),是一種DNA水解酵素,通常是從細菌中分離而來。這些DNA水解酵素原本在細菌中的作用是將外來DNA分解成小片段,以「限制」外來DNA侵入危害細菌本身。限制酶藉由辨識特定的DNA序列(稱為限制酶位點,restriction site),並在此限制酶位點將雙股DNA切斷。不同的限制酶其限制酶位點也不同。

    限制酶的應用:

    (1)1970年,美國遺傳學家Hamilton Smith發現第二型的限制酶,這種酵素可以切斷DNA雙股螺旋於特定的辨識切點上,使得基因重組不再是空想,而可能成真。

    (2)1972年,美國微生物學家Daniel Nathans使用限制酶(切DNA雙股螺旋分子的酵素)去標定一種會造成猴子癌症之病毒(Monkey Simple virus)的DNA。這是第一次使用這一類酵素來對一段已知的DNA進行標定的工作。

    (3)1973年,美國生物化學家Stanley Cohen和Herbert Boyer將來自某一物種的DNA被限制酶酵素切成幾個片段,並且放入其他物種的DNA內發展出重組DNA的技術,此為基因工程技術的起始點。

    「限制酶在自然界的功能」也包含了「限制酶在生化分生方面的應用」,不是嗎?

  • 限制酶是一種切割DNA的酵素

    他能辨識特定的序列然後一刀切下去

    既然是問他在自然界的功能~~那就來說吧

    當(某些)細菌遭遇到不明遺傳物質攻擊時~~EX病毒

    病毒會把遺傳物質注入細菌

    這時細菌為了不受攻擊

    限制酶就出馬了

    他可以(假如有可以辨識出的特定序列)把那遺傳物質切切切

    降他就不會被感染了

    但是一個細菌怎麼可能有所有的限制酶

    所以他還是會被感染

    假如病毒的遺傳物質都切斷了,那他怎麼繁殖

    所以他又演化出不被(特定)限制酶辨識的遺傳序列

  • 2 decades ago

    限制酶在原核生物的作用.原本只是當作一種防禦性質.當外來DNA被攝入時.只要經過原核生物本身的辨識系統.察覺到非本身的DNA.就可以利用特殊的限制酶把外來的降解掉...

    至於他們是如何辨識.就是甲基化的現象了.在此便不在贅述

    Source(s): 分生
  • 2 decades ago

    質體DNA之限制酶切割與電泳分析

    --------------------------------------------------------------------------------

    I.目的

    本實驗是將上一節課分離得到的質體DNA,以不同的限制酶切割,經洋菜膠電泳分離DNA片段後,比較各DNA片段之泳動率與分子量,檢定質體之正確性或截切所需DNA片段以進行重組質體DNA(recombinant plasmid DNA)之建構。限制核酸內切酶(Restriction endonucleases)為一種特別的酵素,它們對雙股DNA中氮鹼基順序的確認具有專一性,也是生物技術上一種很重要的工具。在原核生物(Prokaryotics)細胞中它們作用於鑑識修飾系統中,並能把侵入細菌或大腸桿菌的外來DNA(如噬菌體)截切,但不會切割自己已甲基化的宿主染色體DNA。限制酶大體可分為三個系統,其中第II型最為重要,在大多數生物技術中,均會用到第II型限制酶。此種限制酶會認知長4~6 bp(或更長)等不同的核苷酸序列,很準確的在某一點上切DNA成對稱的兩軸交互分開,這種交互切口會使DNA片段的5’和3’懸空成sticking end, 例如:

             ↓

      EcoRI認識 5′-GAATTC-3′

               3′-CTTAAG-5′

                   ↑

      或切齊DNA成為blunt end的斷片。例如:

               ↓

         SmaI認識 5′-CCCGGG-3′

              3′-GGGCCC-5′

                 ↑

     本實驗介紹的第二種技術是洋菜膠電泳。把agarose熱溶再冷凝,洋菜膠會以氫鍵形成凝膠。而經限制酶切過的DNA片段,在電場影響下會在agarose gel中移動,帶負電荷的DNA分子會向正極方向移動。移動速度依分子大小而定,分子愈大移動性愈慢。而凝膠中agarose的濃度決定了空隙的大小,特定大小的DNA片段在不同濃度的膠中移動速率均不同,故每次均需DNA marker以資比較。核酸在膠體中可經ethidium bromide (EtBr)染色,EtBr會嵌入核酸鹼基中,以紫外線照射,則核酸吸收紫外線波長的光線,再經EtBr放出可見波長的光線,藉以觀察核酸的位置。

    II.限制酶切割與電泳分析

    1.儀器用具:

    a.37 °C水浴或恆溫箱

    b.迷你電泳槽及鑄膠器

    c.UV transilluminator

    d.拍立得相機或數位影像分析系統

    2.藥品及試劑:

    a.限制酶:HindIII及EcoRI,濃度參照標明。

    b.10 x Restriction buffer B:100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM MgCl2, 1 M NaCl, 10 mM 2-mercaptoethanol

    c.10 x追蹤染劑:0.25% bromophenol blue (BPB), 0.25% xylene cyanol (XC), 0.1 M EDTA, 50% glycerol

    d.洋菜膠(agarose)

    e.Ethidium bromide (EtBr):1 mg/ml

    f.1 x TBE電泳緩衝液:89 mM Tris, pH 8.0, 89 mM boric acid, 0.2 mM EDTA, pH 8.0

    g.DNA marker

    3.材料:

    質體pINDlacZ及載體pT7-6之DNA

    4.方法步驟:

    1)取2支1.5 ml微量離心管,分別標上“pINDlacZ”及“pT7-6”,依序加入下列各項:

        water

      10 x Restriction buffer

      plasmid DNA

      EcoRI

      HindIII

    --------------------------------

      Total

    請注意:

    限制酶永遠是最後加入,並儘速放回-20 °C冰櫃中,每次吸取限制酶時,務必換一支新的yellow tip(微量吸管頭)以避免造成限制酶被污染。限制酶中含50% glycerol以防凍結,故用量不可超過反應總體積的1/10,否則將造成反應受抑制。切割1 mg質體DNA約需2 units限制酶。

    2)將這些管子置於37 °C中作用1~2小時。

    3)另取2支1.5 ml微量離心管,分別放入pINDlacZ及pT7-6,加入追蹤染劑進行電泳分析,當作對照組,以檢視切割是否完全。

    4)在限制酶反應期間,每組製備1% agarose gels由助教帶領。按廠商說明把迷你膠體電泳儀器組合起來,加入0.2 g洋菜膠溶於25 ml 1 x TBE buffer(原先溶於20 ml中,但加熱沸騰會減少體積),置於微波爐中加熱使洋菜膠粒全溶(注意!防止突沸及膠液外溢)。讓洋菜膠在室溫冷卻30分鐘以上,待手持膠液不燙手時,加入2.5 ml EtBr,隨即倒入鑄膠器內使之凝結。(注意!EtBr為突變劑)未使用的電泳膠片可以保鮮膜封存,或浸入1 x TBE內,置於4 °C冰箱中,留待下次再使用。

    5)限制酶反應完,加入追蹤染劑,與對照組進行電泳,並放入DNA marker以資比較,連接電源插頭(黑色為負極-,紅色為正極+)到電源,帶負電荷的DNA分子會由負極移向正極,在50 vol中跑膠約1小時,或直至BPB染劑前端距膠底1.5 cm。(注意!勿碰觸高壓電的電泳儀器)

    6)戴手套把洋菜膠放在強UV透射光源板上,即可對結果拍照存檔,儘量減少你身體(臉或手)和膠體暴露於UV下過久,有時會使DNA產生缺口或突變。

    6)pT7-6為2.2 kb大小的載體DNA,在電泳中應看到單一條2.2 kb大小的DNA片段,照相後,以刀片將此DNA切下,做DNA純化及濃縮(參見實驗2)。pINDlacZ為8.2 kb大小的質體DNA,在電泳中應見到兩條DNA片段,一為5 kb的載體部分,另一為3.2 kb的lacZ基因片段,照相後,以刀片將此3.2 kb lacZ基因切下,亦做DNA純化及濃縮。

     

    目錄  實驗二  實驗四

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  • Anonymous
    2 decades ago

    對阿 我們都不知道限制酶在自然界 是什麼勒 就有人發問 回家念書吧

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